Transgenesi

Uso di vettori plasmidici



Le tecnologie attuali utilizzate per il trasferimento di geni attraverso la linea germinale di mammiferi richiede l'integrazione di DNA esogeno in un sito casuale all'interno del genoma ospite.

Tuttavia, questo processo può generare effetti indesiderati, in quanto può posizionarsi non correttamente nel genoma dell'ospite o portare mutazioni nocive.

Cromosomi artificiali di mammiferi sono buoni vettori per la produzione di transgeni, così come per la produzione di proteine cellulari e per applicazioni di terapia genica.

Tutto questo perché hanno il vantaggio di:

1- avere al capacità di trasportare molecole di DNA di grandi dimensioni;

2- avere la possibilità di replicare in parallelo col genoma dell'ospite, ma non integrato in esso;

3- avere al capacità di venir trasmessi attraverso la linea germinale.

Il DNA satellite artificiale basato su cromosomi (SATAC) contiene: un'origine non virale di replicazione, i telomeri e il centromero.

La transgenesi e il successivo monitoraggio della presenza del cromosoma artificiale prevede i seguenti passaggi:

1- Isolamento dei SATAC, citometria a flusso, e quindi raccolta per centrifugazione.

2- Coltivazione degli embrioni (per esempio di topo).


3- Esecuzione di una microiniezione dei SATAC nei pronuclei del topo, usando micropipette di vetro borosilicato.

4- Estrazione totale del DNA genomico e amplificazione mediante PCR per valutare la presenza di Igromicina.

Si procede poi con la colorazione della B-galattosidasi per verificare l'attività del gene lac Z (entrambi i geni sono presenti nel SATAC).

5- Esecuzione, su embrioni coltivati su Colcemid (cellule bloccate in fase M), di un'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde di DNA satellite, lac Z e HPH.


Si è osservato che i cromosomi artificiali possono essere trasmessi, durante la mitosi, alla prole transgenica della persona, consentendo la sopravvivenza di una percentuale accettabile di individui.

La creazione di topi transgenici con i SATAC permette applicazioni nella genomica funzionale e creazione di modelli animali di malattie umane.


***
Analisi dell'espressione del transgene
***


Dopo che il transgene è stato introdotto nella cellula bersaglio, bisogna verificare se si esprime correttamente nel suo nuovo ambiente. Risulta pertanto opportuno analizzare i livelli di espressione del suo RNA e delle sue proteine.

Per determinare l'attività trascrizionale del transgene si possono usare varie tecniche: Northern blot, RT PCR e ibridazione in situ.

Invece per l'analisi dell'espressione del transgene a livello della traduzione si usano Western blot e immunoistochimica.

Sono possibili variazioni nell'espressione del transgene in seguito al diverso sito di integrazione dello stesso.

Ad esempio i primi topi che esprimevano il transgene per l'ormone della crescita, presentavano dimensioni del corpo raddoppiate rispetto ai topi wild type; i ricercatori hanno concluso affermando che la quantità di cDNA introdotta, sotto il controllo del promotore inducibile del gene della metallotioneina, era eccessiva e non regolata.

Per questo è necessario inserire ulteriori regioni regolatrici specifiche per il gene in questione.



Segue